5种合成siRNA分子方法及途径的比较-RNAi
目前，实验人员都采用将siRNA分子导入细胞内的方法进行RNAi的研究。现在一共有5种合成siRNA分子方法及途径：
1. 化学合成。
2. 体外转录。
3.“鸡尾酒”法（RNaseIII酶切dsRNA）。
4. 质粒、病毒载体介导的siRNA体内表达。
5. siRNA表达框介导的siRNA体内表达。
前三种方法都是在体外得到siRNA分子后，利用转染、电转化等方法直接将siRNA导入哺乳动物的细胞；后两种方法以载体与siRNA表达框为媒介，使siRNA分子在细胞内表达。实验人员可根据实验的目的与情况，选择具体方法进行实验。
除RNaseIII酶切dsRNA的方法外，用上述其余4种方法合成siRNA之前都要根据目标基因设计特定的siRNA序列。如要得到1个效率高的siRNA，一般需要设计3~4个siRNA并在此基础上进行实验、筛选。
为了帮助提高设计siRNA的效率，Cenix BioScience——Ambion的合作伙伴，开发出了专门用于设计siRNA的软件，可大大减少测试siRNA的数量，使研究人员能快速地得到高效率的siRNA。（详情www.ambion.com/siRNA）
一．化学合成
客户设计出siRNA序列后，由合成仪按照序列进行合成及后续的纯化。Ambion公司可根据客户的siRNA序列提供合成服务，也可使用Cenix BioScience的专业软件替客户设计序列后进行合成。
Ambion合成的siRNA产品都经过MALDI-TOF的检测，并提供相关的数据。其纯度分为3类：普通级（脱盐、脱保护，纯度大于80%），HPLC级（纯度大于97%），PAGE级（纯度大于97%）。
该方法的优点是得到的siRNA纯度高并且无需进行任何其他实验，但缺点是价格高昂。所以目前研究人员更多采用的方法是利用相对廉价的方法合成siRNA进行筛选，在确认高效率的siRNA后，再利用化学合成法合成siRNA进行实验。体外转录就是一种廉价的方法。
二．体外转录
针对siRNA的序列合成对应的DNA链，再利用RNA聚合酶进行体外转录，转录产物即可导入细胞。Ambion的SilencerTM siRNA Construction Kit就是采用此类方法的试剂盒。
该方法的优点是价格便宜，试剂盒使用方便，但缺点是需要进行其他实验，且siRNA的合成量受到限制。
三．“鸡尾酒”法（RNaseIII酶切dsRNA）
从一些siRNA序列中筛选出效率最高的1个siRNA分子是RNAi研究的一大瓶颈，针对这种情况，研究人员提出了一种称为“鸡尾酒”的siRNA制备方法。该方法是模仿了siRNA在体内的工作原理，其过程如下：首先针对靶基因的mRNA在体外转录合成长dsRNA；再用RNaseIII或Dicer对长dsRNA进行酶解，形式一组siRNAs的混合物；最后将该混合物导入细胞内。Ambion的SilencerTM siRNA Cocktail Kit就是采用此类方法的试剂盒。
该方法的优点是可以避开烦琐的siRNA设计与筛选工作，缺点是有可能产生非特异性基因的抑制，而且在有效地抑制基因表达后并不知道真正起作用的siRNA。
四．siRNA表达载体
上面3种方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这种方法有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA的数量不受控制。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链序列克隆入载体内，位于RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。
该方法的优点是使siRNA直接在体内得到表达，是用于RNAi长期研究的唯一方法。在载体上的抗性标记能帮助快速筛选出阳性克隆，目前包括Ambion在内的一些公司已开发出病毒类的载体（如腺病毒载体），这样就可使siRNA进入更多种类的细胞内进行研究。由于此方法涉及构建克隆，所以需要进行大量的实验，如构建克隆、序列测定等。现在Ambion公司能够提供10种质粒载体，其中带有不同的启动子与抗性标记，如小鼠的U6启动子、人的U6启动子、人的H1启动子，抗性标记有嘌呤霉素、新霉素、潮霉素。
五．siRNA表达框
2. 体外转录。
3.“鸡尾酒”法（RNaseIII酶切dsRNA）。
4. 质粒、病毒载体介导的siRNA体内表达。
5. siRNA表达框介导的siRNA体内表达。
前三种方法都是在体外得到siRNA分子后，利用转染、电转化等方法直接将siRNA导入哺乳动物的细胞；后两种方法以载体与siRNA表达框为媒介，使siRNA分子在细胞内表达。实验人员可根据实验的目的与情况，选择具体方法进行实验。
除RNaseIII酶切dsRNA的方法外，用上述其余4种方法合成siRNA之前都要根据目标基因设计特定的siRNA序列。如要得到1个效率高的siRNA，一般需要设计3~4个siRNA并在此基础上进行实验、筛选。
为了帮助提高设计siRNA的效率，Cenix BioScience——Ambion的合作伙伴，开发出了专门用于设计siRNA的软件，可大大减少测试siRNA的数量，使研究人员能快速地得到高效率的siRNA。（详情www.ambion.com/siRNA）
一．化学合成
客户设计出siRNA序列后，由合成仪按照序列进行合成及后续的纯化。Ambion公司可根据客户的siRNA序列提供合成服务，也可使用Cenix BioScience的专业软件替客户设计序列后进行合成。
Ambion合成的siRNA产品都经过MALDI-TOF的检测，并提供相关的数据。其纯度分为3类：普通级（脱盐、脱保护，纯度大于80%），HPLC级（纯度大于97%），PAGE级（纯度大于97%）。
该方法的优点是得到的siRNA纯度高并且无需进行任何其他实验，但缺点是价格高昂。所以目前研究人员更多采用的方法是利用相对廉价的方法合成siRNA进行筛选，在确认高效率的siRNA后，再利用化学合成法合成siRNA进行实验。体外转录就是一种廉价的方法。
二．体外转录
针对siRNA的序列合成对应的DNA链，再利用RNA聚合酶进行体外转录，转录产物即可导入细胞。Ambion的SilencerTM siRNA Construction Kit就是采用此类方法的试剂盒。
该方法的优点是价格便宜，试剂盒使用方便，但缺点是需要进行其他实验，且siRNA的合成量受到限制。
三．“鸡尾酒”法（RNaseIII酶切dsRNA）
从一些siRNA序列中筛选出效率最高的1个siRNA分子是RNAi研究的一大瓶颈，针对这种情况，研究人员提出了一种称为“鸡尾酒”的siRNA制备方法。该方法是模仿了siRNA在体内的工作原理，其过程如下：首先针对靶基因的mRNA在体外转录合成长dsRNA；再用RNaseIII或Dicer对长dsRNA进行酶解，形式一组siRNAs的混合物；最后将该混合物导入细胞内。Ambion的SilencerTM siRNA Cocktail Kit就是采用此类方法的试剂盒。
该方法的优点是可以避开烦琐的siRNA设计与筛选工作，缺点是有可能产生非特异性基因的抑制，而且在有效地抑制基因表达后并不知道真正起作用的siRNA。
四．siRNA表达载体
上面3种方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这种方法有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA的数量不受控制。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链序列克隆入载体内，位于RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。
该方法的优点是使siRNA直接在体内得到表达，是用于RNAi长期研究的唯一方法。在载体上的抗性标记能帮助快速筛选出阳性克隆，目前包括Ambion在内的一些公司已开发出病毒类的载体（如腺病毒载体），这样就可使siRNA进入更多种类的细胞内进行研究。由于此方法涉及构建克隆，所以需要进行大量的实验，如构建克隆、序列测定等。现在Ambion公司能够提供10种质粒载体，其中带有不同的启动子与抗性标记，如小鼠的U6启动子、人的U6启动子、人的H1启动子，抗性标记有嘌呤霉素、新霉素、潮霉素。
五．siRNA表达框
siRNA表达框的本质是一段含有能表达siRNA分子的PCR产物，无需克隆入载体即可导入细胞抑制特定基因的表达。在表达框的上游含有RNA聚合酶III的启动子，在下游含有RNA聚合酶III的终止序列。siRNA表达框介导的siRNA表达也属于体内表达的方法，与siRNA表达载体相比其优点是无需克隆可直接导入细胞，但在表达框的两端加上酶切接头后也可克隆入载体，方便客户使用。Ambion公司的SilencerTM siRNA Expression Cassette Kit就是采用该方法的试剂盒。
| 比较项目 | 化学合成 | 体外转录 | RNase III | 质粒载体 | 腺病毒载体 | 逆转录病毒 载体 | PCR |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
材料需求 | 21-mer RNA oligos(一对) | 29-mer DNA oligos(一对) | 转录模版(200-000bp，两侧带T7 启动子) | 55-60-merDNA oligos (一对) | ０ | ０ | ~50-mer DNA oligos(一对 |
全部制备/ 合成时间 所需时间 | 4天—2周 | 24 小时 + DNA oligo合成时间 | 1 天 + 转录模版制备时间 | 5天以上 + DNA oligo合成时间 | ~ 6 小时+ DNA oligo合成时间 | 0 | 0 |
个人所需 | 几乎不需要 | 中等 | 中等 | 多 | 多 | 多 | 中等 |
是否需要验证和寻找最有效siRNA | 需要 | 需要 | 不需要 | 需要 | 需要 | 需要 | 需要 |
能否标记siRNA | 能 | 能 | 能 | 不能 | 不能 | 不能 | 不能 |
转染的相对 | 好 | 好 | 好 | 中等 | 好 | 很好 | 很差 |
可筛选性 | 不可以 | 不可以 | 不可以 | 可以 | 可以 | 可以 | 不可以 |
能否适用于长效抑制 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 适用 | 不适用 |
能否大规模制备 | 可以 | 有限 | 有限 | 可以 | 可以 | 可以 | 有限 |
检测总体转染效率 | 不可以 | 不可以 | 不可以 | 可以 | 可以 | 可以 | 不可以 |
每个基因的相对费用（不包含人力） | 很高 | 中等 | 低 | 低 | 高 | 中等 | 中等 |
优点 | 方便，几乎无需研究人员工作 | 得到siRNAs的时间短 | 无需检测和筛选有效siRNA序列，较省钱 | 可以简单地大量制备 | 导入效率高，可感染静止期的细胞 | RNAi效果可永久持续 | 得到siRNAs的时间非常短 |
缺点 | 费用高，定制周期长 | 实验规模受到限制 | 可能易引发非特异性沉默 | RNAi效果持续时间短，导入效率低 | RNAi效果持续时间短，制备病毒较费时间 | 不能感染静止期的细胞 | 很难转染 |
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